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      饲料添加肠膜蛋白对南美白对虾生长性能、消化、免疫和应激反应的影响

      饲料添加肠膜蛋白对南美白对虾生长性能、消化、免疫和应激反应的影响

      杨闯1,胥学新2,江生2,李珍2,曹小娟13,高坚[1]3

      1华中农业大学水产学院,华中农业大学,武汉 430070

      2北京中科景明生物技术有限公司,北京 100193

      3华中农业大学水产养殖国家级实验教学示范中心,华中农业大学,武汉 430070

      要:本研究探讨了饲料中添加肠膜蛋白对南美白对虾(Litopenaeus vannamei)生长性能、消化、免疫和应激反应的影响。实验设置四种配合饲料,以未添加肠膜蛋白作为对照组(0%),在饲料中分别添加2.5%5%10%的肠膜蛋白,选择初重约为0.21±0.01g的南美白对虾,分别投喂四种配合饲料,每种饲料3个重复,分别在20d40d时,取样统计生长性能,检测相关消化酶和免疫酶活性,肝胰脏相关免疫基因mRNA的表达水平,并进行氨氮胁迫应激实验。结果显示:喂养20d时,5%组幼虾末体重、增重率、特定生长率显著高于其它组(P<0.05)。在肝胰脏中,5%组的碱性磷酸酶、总超氧化物歧化酶和脂肪酶酶活显著高于其它组(P<0.05)。在氨氮应激48h后,发现5%组的存活率高于其它各组。肠膜蛋白组肝胰脏中proPOPE的表达量显著高于对照组(P<0.05);喂养40 d的成虾,同样是5%组的末体重、增重率、特定生长率显著高于其余各组(P<0.05)。酸性磷酸酶、总超氧化物歧化酶、溶菌酶和脂肪酶酶活5%组最高(P<0.05)。5%组的氨氮胁迫存活率高于0%2.5%10%组。5%proPOPE的表达量显著高于0%2.5%10%(P<0.05)综上所述:南美白对虾饲料中添加5%肠膜蛋白可改善南美白对虾生长性能、消化酶活性及免疫应激水平。

      关键词:南美白对虾;肠膜蛋白;生长;抗氧化性能。

      肠膜蛋白作为一种新型功能营养性动物蛋白质原料,其蛋白含量高,富含丰富的小肽和游离氨基酸,是替代血浆蛋白粉、乳清粉、鱼粉等昂贵蛋白原料的选择之一[1]。 另外,肠膜蛋白可以提高抗病性,增强动物免疫力,提高消化道酶活性。高欣等[2]研究表明,添加肠膜蛋白能明显提高断奶仔猪(Susscrofa domestica)生长性能和降低腹泻指数,且有提高消化道酶活性的趋势。肠膜蛋白源于健康猪肠道上皮黏膜,是一种新型功能营养性动物蛋白质原料,不仅含有丰富的蛋白质、脂肪、纤维和磷、钙、钾等矿物质元素,还含有大量的小肽和游离氨基酸,且水溶性好,可以更易、更快的被机体吸收利用[3-6]。另外新的蛋白质营养理论中表明,小肽可以在动物消化道被完整的吸收[7]。在动物饲料中添加肠膜蛋白,不仅可以减少鱼粉的用量,也可以有效的促进动物生长,提高饲料利用率。Myers[8]研究结果表明,饲喂肠膜蛋白粉能显著地提高断奶仔猪的平均日增重,降低料肉比。Rouchey[9]研究发现,对于20日龄断奶仔猪,饲喂肠膜蛋白粉可以显著提高平均日增重, 降低料肉比。要秀兵等[10]21日龄断奶的PIC配套系五元杂交仔猪进行研究,发现添加肠膜蛋白组的平均日增重高于对照组, 而饲料增重比低于对照组。关于肠膜蛋白在水产动物饲料中的相关研究还鲜有报道。杨志强等[11]通过测定凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)对花生粕、玉米蛋白粉、羽毛粉、肠膜蛋白粉、鸡肉粉、肉骨粉和喷雾干燥血粉粗蛋白和氨基酸的消化率,表明凡纳滨对虾对肠膜蛋白的粗蛋白消化率和氨基酸消化率最高。尽管肠膜蛋白在凡纳滨对虾的生长性能有着很好的添加效果,但关于凡纳滨对虾饲料肠膜蛋白的最适添加水平,及其对凡纳滨对虾的生长,消化吸收等生理指标的研究还未见报告。

      南美白对虾学名凡纳滨对虾,别名凡纳对虾、白脚虾等,是当今世界养殖产量最高的三大虾类之一[12]南美白对虾具有个体肥硕、肉质鲜嫩、营养丰富、营养需求低、生长快、出肉率高、抗病力强、适温适盐范围广等优点,现已成为我国对虾养殖区的主要养殖品种[13]。然而,在南美白对虾养殖过程中还存在众多问题。例如:饲料中鱼粉的大量使用、病害频发、抗胁迫能力低等问题。因此,本实验对不同生长阶段南美白对虾的生长性能、相关消化酶和免疫酶活性、氨氮胁迫存活率及免疫相关基因表达等方面综合探讨肠膜蛋白对鱼粉的可替代性及适宜替代水平,旨在为南美白对虾优化型饲料的研发、肠膜蛋白在南美白对虾饲料中的添加效果提供基础数据。

      1    幼虾实验用饲料配方及营养组成

      Tab. 1    Formula and nutrition composition of juvenile shrimp for experiment (%)

      原料Ingredient

      0%

      2.5%

      5%

      10%

      鱼粉 Fish meal

      磷虾粉 Krill meal

      豆粕 Soybean meal

      糊精Dextrin

      α淀粉 α-Starch

      鱼油 Fish oil

      大豆卵磷脂 Soy lecithin

      胆固醇 Cholesterol

      高筋面粉 Bread flour

      维生素混合物 Vitamin mixturea

      矿物质混合物 Mineral mixtureb

      安定-C35 Stability - C35

      氯化胆碱 Choline chloride

      柠檬酸钠 Sodium citrate

      琥珀酸钠 Sodium succinate

      氨基葡()糖盐酸 Glucosamine hydrochloric acid

      角叉菜胶 Carrageen glue

      肠膜蛋白 Intestinal membrane protein

      合计Total

      营养水平 Proximate composition

      粗蛋白 Crude protein

      粗脂肪 Crude lipid

      粗灰分 Ash

      水分 Moisture

      41.00

      5.00

      15.00

      3.00

      8.00

      2.00

      2.00

      5.00

      5.00

      4.00

      4.00

      0.20

      0.60

      0.60

      0.60

      1.00

      3.00

      0.0

      100.00

      42.36

      6.54

      10.03

      9.56

      38.5

      5.00

      15.00

      3.00

      8.00

      2.00

      2.00

      5.00

      5.00

      4.00

      4.00

      0.20

      0.60

      0.60

      0.60

      1.00

      3.00

      2.5

      100.00

      42.56

      6.78

      9.86

      9.45

      36.0

      5.00

      15.00

      3.00

      8.00

      2.00

      2.00

      5.00

      5.00

      4.00

      4.00

      0.20

      0.60

      0.60

      0.60

      1.00

      3.00

      5.0

      100.00

      42.86

      6.81

      9.78

      9.36

      31.0

      5.00

      15.00

      3.00

      8.00

      2.00

      2.00

      5.00

      5.00

      4.00

      4.00

      0.20

      0.60

      0.60

      0.60

      1.00

      3.00

      10.0

      100.00

      42.43

      6.65

      9.82

      9.51

      注:a矿物质预混料(mg/kg饲料): 硫酸镁, 3380; 磷酸氢二钠, 2153.33; 磷酸氢二钾, 5913.33; 柠檬酸铁,733.33;乳酸钙, 8060; 氢氧化铝, 6.67; 硫酸锌, 86.67; 硫酸铜, 2.67; 硫酸锰, 20; 碘酸钙, 6.67; 硫酸钴, 26.67; b维生素预混料 (mg/kg饲料): β-胡萝卜素, 32.12; 维生素C, 230; 维生素D3, 3.24; 亚硫酸氢钠甲萘醌, 15.28; DL-α-维生素E醋酸酯, 12.68; 硝酸硫胺素(B1), 19.24;核黄素(B2), 64.12; 盐酸维生素B6, 15.28; 维生素B12, 0.04; d-生物素, 1.92; 肌醇, 1283.04; 烟酸, 256.56; 泛酸钙, 89.34; 叶酸, 4.8; (下表同)

      Notes: a Mineral mixture (mg/kg diet): Mg SO4, 3380; Na2HPO4, 2153.33; K2HPO4, 5913.33; Fe Citrate,733.33; Ca Lactate, 8060; Al(OH)3, 6.67; Zn SO4, 86.67; Cu SO4, 2.67; Mn SO4, 20; Ca(IO3)2, 6.67; Co SO4, 26.67; b Vitamin mixture (mg/kgdiet): β-carotene, 32.12; vitamin C, 230; Vitamin D3, 3.24; Menadione Na HSO3. 3H2O (K3), 15.28; DL-α-Tochopherol Acetate (E), 12.68;Thiamine-Nitrate (B1), 19.24; Riboflavin (B2), 64.12; Pyridoxine-HCl (B6), 15.28; Cyanocobalamine (B12), 0.04; d-Biotin, 1.92; Inositol,1283.04; Niacine (Nicotic acid), 256.56; Ca Panthothenate, 89.34; Folic acid, 4.8; (The same below).

      2    成虾实验用饲料配方及营养组成

      Tab. 2    Formula and nutrient composition for adult shrimp experiment (%)

      原料Ingredient

      0%

      2.5%

      5%

      10%

      鱼粉 Fish meal

      磷虾粉 Krill meal

      豆粕 Soybean meal

      糊精Dextrin

      α淀粉 α-Starch

      鱼油 Fish oil

      大豆卵磷脂 Soy lecithin

      胆固醇 Cholesterol

      高筋面粉 Bread flour

      维生素混合物 Vitamin mixture

      矿物质混合物 Mineral mixture

      安定-C35 Stability - C35

      氯化胆碱 Choline chloride

      柠檬酸钠 Sodium citrate

      琥珀酸钠 Sodium succinate

      氨基葡()糖盐酸 Glucosamine hydrochloric acid

      角叉菜胶 Carrageen glue

      肠膜蛋白 Intestinal membrane protein

      合计Total

      营养水平 Proximate composition

      粗蛋白 Crude protein

      粗脂肪 Crude lipid

      粗灰分 Ash

      水分 Moisture

      34.00

      5.00

      20.00

      3.00

      10.00

      2.00

      2.00

      5.00

      5.00

      4.00

      4.00

      0.20

      0.60

      0.60

      0.60

      1.00

      3.00

      0.00

      100.00

      40.36

      6.48

      9.85

      9.51

      31.5

      5.00

      20.00

      3.00

      10.00

      2.00

      2.00

      5.00

      5.00

      4.00

      4.00

      0.20

      0.60

      0.60

      0.60

      1.00

      3.00

      2.5

      100.00

      40.48

      6.72

      9.79

      9.46

      29.0

      5.00

      20.00

      3.00

      10.00

      2.00

      2.00

      5.00

      5.00

      4.00

      4.00

      0.20

      0.60

      0.60

      0.60

      1.00

      3.00

      5.0

      100.00

      40.75

      6.85

      9.75

      9.36

      24.0

      5.00

      20.00

      3.00

      10.00

      2.00

      2.00

      5.00

      5.00

      4.00

      4.00

      0.20

      0.60

      0.60

      0.60

      1.00

      30

      10.0

      100.00

      40.35

      6.59

      9.72

      9.48

      1 材料与方法

      1.1 实验饲料制备

      本实验根据南美白对虾的营养需求,设计了鱼粉含量为41%的幼虾基础饲料(0%)和鱼粉含量为34%的成虾基础饲料(0%)。另外分别配置了肠膜蛋白添加量为2.5%5%10%的幼虾饲料和成虾饲料,用来替代相应比例的鱼粉。四组饲料的其他成分完全相同(表1、表2)。本实验所用肠膜蛋白为北京中科景明公司的“鱼倍壮”产品。饲料原料经粉碎机粉碎,60目筛网过筛后严格按饲料配方称重,逐步进行混匀,随后加入适量的水,用实验制粒机制粒,放于通风处晾干,风干后用粉碎机粉碎,分别经20目、40目、60目筛网过筛制成不同规格的饲料,包装后置于-20℃冰箱保存备用。

      1.2 饲养管理

      试验动物为南美白对虾优质一代虾苗,实验分为幼虾养殖实验和成虾养殖实验,分为四组,每组三个平行。幼虾养殖实验养殖周期20天,成虾养殖实验养殖周期40天。试验初始体重为(0.21±0.03) g,放苗密度200/m2。试验地点为山东省日照市宝祥水产有限公司的工厂化养殖车间,养殖池5 m×5 m,水深1.0-1.2 m。以0%组肠膜蛋白为对照组,2.5%组、5%组和10%组肠膜蛋白为处理组,放养于悬挂在室内水泥池的网箱(1 m×1 m×1 m)中。实验虾用基础饲料驯化7 d后,采用定量投喂。试验期内,刚开始按照对虾体重的5%投料,每天喂5次,分别在05:0009:3014:0018:3023:00,并记录投喂量、水温、p H值、盐度、溶氧等水质参数。投料后,观察对虾摄食情况,及时调整投料量。每天观察对虾摄食、蜕壳、生长情况。试验用水为经过沉淀、砂滤的海水,养殖期间每天早上排污并补充新鲜海水。试验期间连续曝气充氧,定期测定水中氨氮、亚硝酸盐含量。试验期间水温为 27.0-29.0℃,盐度为20~25‰,溶解氧>8.0 mg/LpH值为7.6~8.4,氨氮含量<0.40 mg/L,亚硝酸盐含量<0.30 mg/L

      1.3 样品采集

      养殖实验结束前24 h停止投喂,捞取各网箱中的对虾,称量其体长和体重并记录剩余数量,以计算对虾成活率和增重率。幼虾实验每个养殖网箱中随机捞取南美白对虾20尾,其中10尾取出肝胰脏后迅速放于液氮中保存,用于测定有关消化酶和免疫酶活性以及肝胰脏中免疫基因proPOPEmRNA的表达情况;10尾虾用做氨氮胁迫实验,最终计算氨氮胁迫存活率。成虾实验每个养殖网箱中随机捞取南美白对虾30尾,其中10尾取出肝胰脏后迅速放于液氮中保存,用于测定有关消化酶活性和免疫基因proPOPEmRNA的表达情况;另外随机取10尾虾,抽取血淋巴液,8000 r/min离心20 min,取上清液,于–80℃超低温冰箱保存,用于血清免疫指标的检测;剩余的10尾虾用做氨氮胁迫实验,计算最终氨氮胁迫存活率。

      1.4 营养组成分析

      实验饲料的常规营养分析参照AOAC [14]的方法进行: 水分含量测定采用105℃烘干法, 粗蛋白含量测定采用凯氏定氮法, 粗灰分含量测定用马福炉550℃灼烧法。实验饲料和全鱼体的全脂肪含量分析参照BlighDyer [15]的方法进行。

      1.5 生长指标测定

      分别计算幼虾和成虾的增重率和特定生长率;统计饲料投喂量,计算饲料转化率。

      增重率(weight gain rate,WGR,%)=100×(Wt-W0)/W0

      特定生长率(specific growth rate,SGR,%/d)=100×[(ln Wt-ln W0)]/t

      饲料转化率(Feed conversion rate,FCR)=FI/W

      式中:Wt—试验结束时南美白对虾的平均重量(g)

      W0—试验开始时南美白对虾的平均重量(g)

      FI—试验期间虾摄食饲料的干物质总重量(g)

      W—对虾的增重量(g)

      t—养殖时间(d)

      1.6 氨氮胁迫存活率

      氨氮胁迫实验开始前,每组取10尾虾进行预实验,根据预实验结果,设置幼虾的最终氨氮胁迫实验浓度为70mg/L,成虾最终氨氮胁迫实验浓度为80mg/L。实验时每组取30尾虾进行实验,在50×50×50的水盒中进行实验,试验期间连续曝气,每隔12h吸污一次,及时剔除死亡个体,每隔24h换水一次,换水量为100%,并按时监测各试验液中水温、pH值。定时观察白对虾的活力及存活情况,每隔4h记录南美白对虾的死亡尾数。

      1.7 血清和肝胰脏相关酶活性检测

      对于幼虾相关免疫酶和消化酶的测定,均测定其肝胰脏组织。对于成虾,抽取血淋巴液,4℃离心后取上清测其免疫酶的活性,取肝胰脏组织测其消化酶活性。相关免疫酶和消化酶活性均按照南京建成生物工程研究所所购试剂盒说明书测定。

      1.8 免疫基因表达量

      将超低温冻存的南美白对虾肝胰脏组织按Trizol试剂盒(TaKaRa)说明书提取总RNA。参照Gen Bank公布的南美白对虾cDNA序列设计proPO(登录号: JN393011.1 )基因和PE(登录号:KC708021.1)基因引物及β-actin 内参基因序( 登录号: JF288784.1) ,由Primer Premier 5.0设计(表3)。采用荧光定量PCR方法检测,按照上海翊圣反转录试剂盒说明书将提取的总RNA先反转录为c DNA,再采用SYBRR Green I嵌合荧光法进Real-time PCR反应,反应条件为 95, 10s; 95, 15s; 60, 15s; 40个循环。每个复孔设置参照基因β-actin,根据2ΔΔct计算法进行相对定量后,分析肝胰脏中proPOPE的相对表达量。

      1.9 数据处理和统计分析

      本实验结果用平均数±标准差(mean±SD)表示,所有实验数据均使用SPSS分析软件中的单因素方差分析(One-Way ANOVA)Duncan氏法多重比较进行差异显著性分析,P<0.05,

      认为差异显著 。统计结果以平均值±标准差(Mean±SD)的形式表示。

      3:荧光定量PCR检测免疫基因使用的引物序列

      Table 3: Primer sequences used for quantitative fluorescence PCR detection of immune genes

      目标基因Gene

      引物 Primer

      序列 Sequence (5′—3′)

      ProPO (Prophenoloxidase)

      ProPO-F

      ProPO-R

      TACCTAGTCTTCTTCTTCTACC

      TTATGAGTGATGTCGGAGAG

      PE (Peroxinectin)

      PE-F

      PE-R

      ACCTGGCTTGACTGCTAT

      GCTGGACCGACGATAATG

      β-actin (内参)

      Actin-F

      Actin-R

      GCGAGAAGATGACACAGAT

      GTGGTCGTGAAGGTGTAG

      2 结果

      2.1 幼虾生长性能

      肠膜蛋白添加对南美白对虾生长性能的影响见表4,可以看出喂养20d的幼虾,随着肠膜蛋白添加量的增加,对虾的末体重、增重率、特定生长率呈现先上升后下降的趋势;饲料转化率呈现先下降后上升的趋势。当肠膜蛋白添加量为10%时,对0%组相比对虾的末体重、增重率、特定生长率、饲料转化率均没有明显变化。其中末体重、增重率、特定生长率最高的为5%组,显著高于其余各组(P<0.05);饲料转化率最低的为5%组,显著低于其余各组(P<0.05)

      4:饲料添加肠膜蛋白对南美白对虾幼虾生长性能的影响

      Table 4: Growth performance of juvenile vannamei shrimp after 20 day feeding 

      添加量

      Add the amount

      初始体重

      IBW(g)

      末体重

      FBW(g)

      增重率

      WG(%)

      特定生长率

      SGR(%/d)

      饲料转化率

      FCR(%)

      存活率

      SR (%)

      0%

      0.21±0.01

      1.10±0.01c

      417.70±8.74c

      8.22±0.08c

      1.45±0.01a

      94.67±0.01

      2.5%

      0.21±0.01

      1.32±0.02b

      522.33±13.43b

      9.14±0.11b

      1.26±0.01b

      96.00±0.01

      5%

      0.21±0.01

      1.41±0.02a

      566.12±9.86a

      9.48±0.07a

      1.16±0.01c

      94.50±0.02

      10%

      0.21±0.01

      1.12±0.02c

      421.52±2.73c

      8.26±0.03c

      1.42±0.01a

      94.50±0.01

      注:统计结果以平均值±标准差(Mean±SD)的形式表示, 每组3个平行; 同列数字肩标相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05), 不同小写字母表示差异显著(P?0.05)。下表同

      Note: Values were expressed as mean ± standard deviation (SD) of three experiments in each group; the Numbers shoulder the same letters within the same column or no letter indicates no significant difference (P > 0.05), different small letters mean significant difference (P ? 0.05).The following table

      2.2 幼虾相关免疫酶和消化酶活性

      添加肠膜蛋白对幼虾相关免疫酶的影响如图1,可以看出喂养20d的幼虾肝胰脏碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性随肠膜蛋白水平的增加呈先升高后降低的变化趋势,且在 5%组达到最高,显著高于其余各组 (P 0.05);肠膜蛋白水平对酸性磷酸酶和溶菌酶的活性没有显著影响,但酸性磷酸酶活性在5%组的高于其余各组。添加肠膜蛋白对幼虾相关消化酶的影响如图2,可以看出喂养20d的幼虾肝脂肪酶活性随肠膜蛋白水平的增加呈先升高后降低的变化趋势,且在5%组达到最高,显著高于其余各组 (P 0.05)。此外饲料肠膜蛋白水平对胰蛋白酶和淀粉酶的活性没有明显影响。

      1:肠膜蛋白对南美白对虾幼虾肝胰脏免疫酶指标的影响(ACP:酸性磷酸酶;AKP:碱性磷酸酶;SOD:总超氧化物歧化酶;LZM:溶菌酶。)

      Figure 1: Hepatopancreatic immune enzyme index in juvenile vannamei shrimp after 20 day feeding (ACP: acid phosphatase; AKP: alkaline phosphatase; SOD: total superoxide dismutase; LZM: lysozyme.)

      注:相同小写字母或无字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P?0.05)。下图同

      Note: The same lowercase letters or no letter indicates no significant difference (P > 0.05), different small letters mean significant difference (P ? 0.05).The figure below

      Data 1

      2:肠膜蛋白添加对南美白对虾幼虾肝胰脏消化酶指标的影响PRS:胰蛋白酶;AMS:淀粉酶;LPS:脂肪酶)

      Figure 2: Hepatopancreatic digestive enzyme index of juvenile vannamei shrimp after 20 day feeding (PRS: trypsin; AMS: amylase; LPS: lipase)

      2.3 幼虾氨氮耐受性

      氨氮胁迫实验对南美白对虾存活率的影响如图3,由图3可以看出喂养20d的幼虾氨氮胁迫48h存活率随着饲料肠膜蛋白水平的增加呈先升高后降低的变化趋势,当肠膜蛋白添加量为5%时氨氮胁迫存活率最高,明显高于其余各组;肠膜蛋白添加量为10%时,氨氮胁迫48h存活率与对照组相比没有明显差异。

      Data 1

      3:饲料添加肠膜蛋白对南美白对虾幼虾氨氮胁迫存活率的影响

      Figure 3: Survival rate of juvenile vannamei shrimp expose to ammonia water

      2.4 幼虾肝胰脏免疫相关基因表达

      喂养20d的幼虾肝胰脏中酚氧化酶(proPO)的表达量与对照组相比,随着肠膜蛋白水平的增加呈先升高后降低的变化趋势,当肠膜蛋白量为5%时表达量最高,显著高于其余各组(P<0.05);细胞黏附蛋白(PE)的表达量表达量随着肠膜蛋白水平的增加呈升高趋势,与对照组相比2.5%组没有显著性差异,5%10%组显著升高(P<0.05)。(图4

      Data 1

      4:饲料添加肠膜蛋白对南美白对虾幼虾肝胰脏免疫相关基因的影响

      Figure 4: Hepatopancreatic immune-related genes in juvenile vannamei shrimp after 20 day feeding

      2.5 成虾生长性能

      喂养40d的成虾生长性能见表5,在初始体重一样的情况下,与对照组相比,对虾的末体重、增重率、特定生长率随着肠膜蛋白水平的增加呈先升高后降低的变化趋势,且均在5%组达到最大,显著高于其余各组(P<0.05);在饲料转化率上,添加量为2.5%组和5%组显著低于0%组和10%(P<0.05),其中5%最低,显著低于其余各组(P<0.05)0%组和10组没有明显差异。

      5:饲料添加肠膜蛋白对南美白对虾成虾生长性能的影响

      Table 5: Growth performance of adult vannamei shrimp after 40 days feeding

      添加量

      Add the amount

      末体重

      FBW(g)

      末体重

      FBW(g)

      增重率

      WG(%)

      特定生长率

      SGR(%/d)

      饲料转化率

      FCR(%)

      存活率

      SR (%)

      0%

      4.20±0.05c

      4.20±0.05c

      1884.01±47.23b

      7.47±0.06b

      1.29±0.02a

      94.67±0.01

      2.5%

      4.36±0.03b

      4.36±0.03b

      1955.83±45.18b

      7.56±0.04b

      1.24±0.01b

      96.00±0.01

      5%

      4.74±0.03a

      4.74±0.03a

      2137.37±42.80a

      7.77±0.03a

      1.13±0.01c

      94.50±0.02

      10%

      4.27±0.03c

      4.27±0.03c

      1890.48±94.12b

      7.48±0.05b

      1.27±0.01a

      94.50±0.01

      2.6 成虾血清相关免疫酶活性和肝胰脏消化酶活性

      与对照组相比,喂养40d的成虾血清中酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶活性均随着肠膜蛋白水平的增加呈先升高后降低的变化趋势,其中酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶活性在5%组达到最高,显著高于其余各组(P<0.05);碱性磷酸酶活性在2.5%组达到最高,显著高于5%组和10%(P<0.05)(图5)。添加肠膜蛋白对成虾肝胰脏消化酶的影响见图6,可以看出喂养40d的成虾肝胰脏脂肪酶活性随着肠膜蛋白添加量的增加呈先升高后降低的变化趋势,且均在5%组最大,显著高于0%2.5%10%(P<0.05),此外饲料肠膜蛋白水平对肝胰脏胰蛋白酶和淀粉酶活性没有明显的影响。

      Data 1

      5:肠膜蛋白对南美白对虾成虾血清免疫酶指标的影响

      Figure 5: Serum immune enzyme activities of adult vannamei shrimp after 4 days feeding

      Data 1

      6:肠膜蛋白对南美白对虾成虾肝胰脏消化酶指标的影响

      Figure 6: Hepatopancreatic digestive activities of adult vannamei shrimp after 4 days feeding

      2.7 成虾氨氮胁迫

      肠膜蛋白对成虾氨氮胁迫的影响见图7,可以看出喂养40d的成虾氨氮胁迫48h存活率随着肠膜蛋白添加量的增加呈现先上升后下降的趋势,5%组的存活率明显高于0%2.5%10%组,其余各组存活率没有明显的差异。

      Data 1

      7:饲料添加肠膜蛋白对南美白对虾成虾氨氮胁迫存活率的影响

      Figure 7: Survival rate of adult vannamei shrimp after 4 days feeding expose to ammonia water

      2.8 成虾肝胰脏免疫相关基因表达

      在喂养40d的成虾肝胰脏中,酚氧化酶(proPO)的表达量随着肠膜蛋白添加量的增加呈先上升后下降的趋势(图8),其中2.5%组和5%最高,显著高于0%组和10%(P<0.05);细胞黏附蛋白(PE)的表达量随着肠膜蛋白水平的增加略有升高,但0%组、2.5%组和5%组没有显著性差异,在10%组中显著降低(P<0.05)

      Data 1

      8:饲料添加肠膜蛋白对南美白对虾成虾肝胰脏免疫相关基因的影响

      Figure 8: The gene expressions of hepatopancreatic immune-related genes in vannamei shrimp

      3 讨论

      在哺乳动物研究,霍宝占[16]研究发现,仔猪断奶后饲喂肠膜蛋白粉能显著降低料肉比,同时还证实仔猪日粮中的肠膜蛋白粉均可改善断奶仔猪的生产性能。徐军等[17]研究表明在断奶仔猪日粮中添加肠膜蛋白粉3%6%效果较好,平均日采食量、平均日增重显著提高,过高或过低都会降低其效果。本实验结果也显示,在幼虾饲料中肠膜蛋白添加量为2.5%5%时都可显著增强其生长性能,降低其饲料转化率。这表明肠膜蛋白在南美白对虾饲料中具有促进生长的作用。而当添加量增加为10%时,与对照组相比生长性能没有明显变化,这可能是饲料中肠膜蛋白含量过高可能引起了饲料中氨基酸的不平衡,导致幼虾对饲料利用率的降低,影响其正常生长。类似结果在Myer[8]等和Cho[18]等关于猪饲料中肠膜蛋白添加量的研究中也有所报道。

      高欣等[2]研究结果表明,添加肠膜蛋白能明显提高断奶仔猪生长性能和降低腹泻指数,且有提高消化道酶活性的趋势。甲壳动物消化酶的活性与其食性、发育阶段、营养、温度、pH值、盐度等诸因素密切相关,并同时受到内因和外因的调控[19]。本实验结果表明饲料中添加肠膜蛋白可以增强部分消化酶活性,在幼虾结果中,饲料中添加肠膜蛋白对其脂肪酶和胰蛋白酶的活性有显著性增强。这说明饲料中添加肠膜蛋白可以显著提高南美白对虾部分消化酶的活性,有利于其快速生长。这可能是由于肠膜蛋白含有较多有利于消化吸收的生物因子,更有利于对虾的消化吸收。在成虾实验结果中肠膜蛋白添加量为5%组的淀粉酶和脂肪酶活力显著高于0%2.5%10%(P<0.05)2.5%5%组的胰蛋白酶活力显著高于0%10%(P<0.05)。这和幼虾实验结果有所不同,原因可能是由于在成虾的养殖过程中,每天的摄食量比幼虾更多,养殖时间更长,肠膜蛋白对成虾的影响更加显著。同时也说明肠膜蛋白的添加可以增强南美白对虾肝胰脏部分消化酶的活性。

      肠膜蛋白粉富含短链肽和平衡的氨基酸,而短链肽和游离氨基酸具有较高的生物学活性,能够增强动物特别是幼龄动物的生产性能和免疫功能,以及减少动物采食植物性或动物性异源大分子蛋白而出现的肠道免疫应激[20]。要秀兵等[10]研究发现,肠膜蛋白粉能够促进淋巴细胞增殖,有利于断奶仔猪免疫能力的提高。与脊椎动物不同,甲壳动物免疫系统以非特异性免疫为主,体液中不含有免疫球蛋白,无抗体介导的免疫反应,体液免疫反应主要依靠血液淋巴中的一些酶[21]。酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶 (AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LZM)是反映对虾免疫能力的重要指标,在对虾防御反应中具有非常重要的作用。在本实验中,幼虾结果表明,饲料中添加肠膜蛋白可以使对虾体内碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活力显著升高;酸性磷酸酶(ACP)和溶菌酶(LZM的活性也有所升高但没有显著性差异。这是由于肠膜蛋白生物利用率高,可以提高动物抗病性,增强免疫力。同样的在成虾实验中,5%组的酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶活力显著高于0%2.5%10%(P<0.05)2.5%5%组的碱性磷酸酶活力显著高于0%10%(P<0.05)。这同样说明肠膜蛋白的添加增强可以南美白对虾部分免疫酶活性,其在成虾中比幼虾更加明显。但在本实验中当肠膜蛋白添加量过高时则会导致其相关免疫酶活性下降。

      在夏季高温时,南美白对虾养殖水体中容易积累较高浓度的氨氮和亚硝酸氮,从而造成对虾死亡。关于肠膜蛋白对水产动物氨氮耐受性的研究鲜有报道,因此在本实验对南美白对虾的氨氮耐受性进行了研究,以确定肠膜蛋白的添加对南美白对虾耐氨氮能力的影响。本实验幼虾结果显示,肠膜蛋白的适当添加可以提高南美白对虾幼虾的氨氮耐受性,最适合的添加量为5%,这可能是由于适量的肠膜蛋白添加增强了南美白对虾自身的环境适应能力和抗应激能力。同样的,在成虾实验中,结果与幼虾一致,肠膜蛋白添加量为5%组的氨氮胁迫48h存活率明显高于0%2.5%10%组。这些结果表明了适量的肠膜蛋白添加可促进南美白对虾的耐受能力。

      酚氧化酶(proPO)是一种含铜的氧化还原酶,其反应链的短暂中间产物拥有很高的生物毒性,能够抑制病原体胞外蛋白酶以及几丁质酶的活性,属于一种酶级联反应系统,在南美白对虾抵抗病原菌侵袭过程中具有重要作用[22]。细胞黏附蛋白(PE)是一种重要的细胞黏附蛋白,其生物活性伴随着proPO系统的激活而活化,同时还具有调理素活性、促包囊形成和过氧化物酶的活性等[23]。在幼虾实验中,结果表明随着肠膜蛋白添加量的增加proPO PE的表达量随之增加,当添加量为5%proPO的表达量达到最高,当添加量为10%proPO的表达量下降。有所不同的是,在成虾实验中,肠膜蛋白添加量为2.5%5%组的ProPO表达量显著高于0%、和10%(P<0.05)0%2.5%5%组的PE表达量显著高于10%(P<0.05)。这表明肠膜蛋白的添加可以增强南美白对虾肝胰脏免疫相关基因的表达量,并且在幼虾和成虾中有所差异。这可能是由于幼虾和成虾机体的差异性导致,具体的影响机制有待进一步的研究。

      综上所述,在南美白对虾幼虾和成虾饲料中添加肠膜蛋白替代鱼粉用量5%,可以显著提高南美白对虾的增重率、特定生长率,促进南美白对虾的生长,降低饲料转化率,同时提高了南美白对虾肝胰脏部分消化酶的活力、血清免疫指标和耐氨氮能力。同时生产实际中添加肠膜蛋白替代部分鱼粉,可大大降低饲料配方成本,缓解鱼粉资源的不足,提升饲料使用效果。因此,肠膜蛋白作为鱼粉替代物及添加物在南美白对虾饲料中具有良好的添加效果,其添加量建议为5%

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      Effects of intestinal membrane protein supplementation on growth performance, digestion, immunity and stress response in penaeus praeus

      YANG Chuang1, XU xuexin, JIANG sheng, LI Zhen3, CAO Xiaojuan1, 2, GAO Jian1, 2

      (1 College of Fisheries, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China;

      2 Beijing Zhongke Jingming Biotechnology Co. Ltd., Beijing 100193;

      3 China National Aquaculture Experimental Teaching Demonstration Center; Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China;)

      Abstract: This study was designed to investigate the effects of dietary intestinal membrane protein (IMP) levels on growth performance, feed utilization, antioxidant capacity and immune response in vinnamei shrimp. Four isonitrogenous and isolipidic experimental diets were formulated to contain 0%, 2.5%, 5%, and 10% IMP. Each diet was fed to triplicate groups of shrimp (0.21±0.01g) for 20 and 40 days. For 20 days, the results showed that the weight gain rate and specific growth rate of juvenile shrimp in the 5% group were significantly higher than those in other groups (P<0.05). The enzyme activities of alkaline phosphatase, total superoxide dismutase, lipase and trypsin in the 5% group were significantly higher than those in the other groups (P<0.05). Under the condition of ammonia-nitrogen stress, the survival rate increases first and then decreases with the increase of substitution amount. The ProPO and PE expression levels in the liver and pancreas of the intestinal membrane protein group were significantly higher than those of the control group (P<0.05). For 40 day feeding, the results showed that the final weight, weight gain rate and specific growth rate of the 5% group were significantly higher than those of the other groups (P<0.05). The activities of acid phosphatase, total superoxide dismutase, lysozyme, amylase and lipase were the highest in the 5% group (P<0.05). The survival rate under ammonia stress in the 5% group was higher than that in the 0%, 2.5% and 10% groups. The ProPO and PE expression levels in the 5% group were significantly higher than those in the 0%, 2.5% and 10% groups (P<0.05). In conclusion, dietary 5% IMP supplementation could improve growth performance, digestion, immunity in vinnamei shrimp.

      Keywords: Vannamei shrimp; Intestinal membrane protein; Growth performance; Antioxidant.



      投稿日期:201964

      基金项目:

      作者简介: 杨闯(1993), , 河南驻马店人; 研究方向为鱼类营养与生理。E-mail: 1280346463@qq.com

      通讯作者:高坚,E-mailgaojian@mail.hzau.edu.cn


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